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公祭仪式在侵华日军南京大屠杀遇难同胞纪念馆集会广场举行。现场庄严肃穆，国旗下半旗。约8000名各界代表胸前佩戴白花，默然肃立。10时整，公祭仪式开始，奏唱中华人民共和国国歌。国歌唱毕，全场向南京大屠杀死难者默哀，南京市拉响防空警报，汽车停驶鸣笛，行人就地默哀。默哀毕，在解放军军乐团演奏的《国家公祭献曲》旋律中，解放军仪仗司礼大队16名礼兵抬起8个花圈唐琅探案结局，敬献于公祭台上。
李书磊指出，我们举行国家公祭，就是要宣示牢记历史、不忘过去，珍爱和平、开创未来的坚定立场，展现新时代中国共产党和中国人民继承先烈遗志，书写强国建设、民族复兴新篇章的坚强决心。我们要凝聚团结奋斗、攻坚克难的力量，发扬自信自立、改革创新的精神，坚定守护和平、维护正义的追求。铭记历史是为了更好前行。让我们更加紧密地团结在以习近平同志为核心的党中央周围，万众一心，奋发有为，为以中国式现代化全面推进强国建设、民族复兴伟业而努力奋斗，为人类和平和发展的崇高事业作出更大贡献。
参加过抗日战争的老战士老同志代表，中央党政军群有关部门和东部战区、江苏省、南京市负责同志，各民主党派中央、全国工商联负责人和无党派人士代表，港澳台同胞代表，为中国人民抗日战争胜利作出贡献的国际友人或其遗属代表，南京大屠杀幸存者及遇难同胞亲属代表，国内外相关主题纪念（博物）馆代表，国内有关高校和智库专家代表，中日韩宗教界代表，驻宁部队官兵代表，江苏省各界群众代表等参加公祭仪式。